方案概述

1、菌種：污水中的大腸菌群

2、培養基：乳糖膽鹽液體培養基、伊紅美藍瓊脂EMB、營養瓊脂培養基

3、儀器及器材：電爐、雙目顯微鏡、恒溫培養箱、無菌操作臺、高壓滅菌鍋、恒溫干燥箱

4根接種環、干燥器、冰箱、4個250ml錐形瓶、3支產氣管、17支試管、6套培養皿、14支無菌移液管（12支1ml管、2支10ml管）

注：

1.乳糖膽鹽液體培養基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和膽鹽組成，屬液態、鑒別、增值、半合成培養液，實驗中用于廢水中菌群的培養；

2.伊紅美藍瓊脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、伊紅-美藍和瓊脂。瓊脂平板用于分離純化腸道致病菌，特別是大腸菌群和糞大腸菌群；

3.營養瓊脂培養基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂。用于分離純化后的菌體培養。

一、實驗整體安排

實驗準備；

采樣、恒溫培養富集及初篩；

觀察產氣情況及稀釋、倒培養基、劃線、涂布、倒置培養；

鑒定、接種；

菌種保藏。

二、實驗準備具體操作步驟

①配置培養基(伊紅美蘭瓊脂培養基：7.4g+200mL無菌水、調pH7.2～7.4，營養瓊脂培養基：6.6g+200mL無菌水、調pH7.4±0.2,0.85%生理鹽水、乳糖膽鹽液體培養基2.6g+100mL無菌水，調pH7.4±0.2),，裝瓶，高壓蒸汽滅菌。

②包扎好培養皿，移液管，試管，進行干熱滅菌。

③將配好的乳糖膽鹽液體培養基分裝入三個試管中，每個大約十毫升，包扎，滅菌。

④液體石蠟和涂布棒等其他實驗玻璃器進行滅菌。

三、采樣、培養

取水，湖水，廢水三樣約2～3滴于3支已滅菌的乳糖膽鹽液體培養基試管中，貼好標簽（采樣時間、人物、溫度，采樣地點及天氣情況），塞好棉塞，于恒溫箱（37℃）培養18～24小時；

觀察產氣情況、稀釋

①觀察產氣管有無氣柱，標記陽性管數。

②樣品稀釋：

對已滅菌的5只試管編號（分別為1、2、3、4、5號），從樣液試管取1mL樣品液放入盛有9mL生理鹽水的試管中為1號試管，換一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀釋液。貼明標簽。

采用劃線、涂布法，具體如下：

①涂布平板法：

將已熔化的營養瓊脂培養基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，置培養箱中37℃培養24小時。經培養后挑取單個菌落。

涂布平板法操作：

1.將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中；

2.取少量菌液（不超過0.1ml），滴加到培養基表面；

3.將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s；

4.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。

注意：

1.將涂布器末端浸在盛有體積分數為70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

2.操作中一定要注意防火，不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。）

②平板劃線法：

經培養后挑取單個菌落，接種環以無菌操作沾取少許菌落，在無菌伊紅美蘭瓊脂培養基平板表面進行連續劃線，微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散。在37℃經培養24小時后，可在平板表面得到單菌落。（有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。）

平板劃線操作：

四、鑒定

觀察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，選取符合上述特征的單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢（油鏡）觀察是否為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。

五、菌種保藏

1、斜面低溫保藏法

此法為最常用的一種。一般霉菌；放線菌和有芽孢的細菌可保存2～4個月，酵母菌可保存2個月，無芽孢的細菌最好每周移接一次。操作過程如下：

a.接種：將要保藏的菌種接入斜面培養基上，試管上貼好標簽，寫上菌種名稱，時間。

b.培養：各類菌按其所需溫度和時間進行培養。

c.保藏：選取生長健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用滅菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染雜菌。置于4℃冰箱中保藏。

2、液體石臘保藏法

此法可用不分解石臘的菌種保藏。保存時間是半年至一年。放線菌；霉菌和產芽孢菌可保藏二年。液體石臘可防止培養基水分的蒸發，而引起的菌種死亡。同時可阻止氧氣進入，防止好氧菌的生長。從而延長菌種保藏的時間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作過程如下：

a.液體石臘的滅菌：將液體石臘裝入錐形瓶中，量不超出錐形瓶體積的1/3，塞上棉塞，包扎好后，進行高壓蒸汽滅菌二次（120℃30分鐘）。再在110～120℃干燥箱中蒸發掉蒸汽滅菌時帶入的水分。此時石臘透明清亮狀。經檢驗確定無菌后備用。

b.菌種培養：將所需的菌種經培養后，選取健狀的保藏。

c.加石臘油：用無菌管吸取石臘油加入菌種試管中，以高出菌種斜面頂點1cm為宜。少了會因培養基露出油面，而使培養基變干造成菌死亡。

d.收藏：試管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4℃。

e.恢復使用：當要使用菌種時。傾出石臘油。此石臘油可再滅菌重復使用。接種培養。由于菌體外粘有油。第一次的菌生長緩慢，性狀恢復不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌種。

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